23. Znázornění žírných buněk ve vazivu. Zalévací media nerozpustná ve vodě

Znázornění žírných buněk ve vazivu
– Žíhaný lem se dá prokázat alciánovou modří
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach v dest. vodě – 5 minut
2) 1% alciánová modř 86X rozpuštěná v 3% kyselině octové 1 – 2 hodiny, oplach v dest. vodě
3) jádrová červeň 5 – 10 minut, oplach v dest. vodě
4) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování

VÝSLEDEK BARVENÍ
Kyselé mukopolysacharidy – modrozeleně
Jádra – červeně

Zalévací media nerozpustná ve vodě
Zalévací media nerozpustná ve vodě se dělí na měkká (parafín) a tvrdá (celoidin)
– Parafín
Parafin je měkké médium nerozpustné ve vodě. Je to nejpoužívanější zalévací médium.
PRINCIP: Parafin pronikne do tkáně, vyplní všechny mikroskopické prostory a vytvoří s tkání jednolitou hmotu, která se dá dobře krájet.
POSTUP: Protože je parafin médium nerozpustné ve vodě, musí se nejprve tkáň prosytit rozpouštědlem parafinu.
1) Fixace – pro zalévání do parafinu se může použít jakákoliv fixační tekutina

2) Odvodnění – tkáň se musí zbavit veškeré vody, aby mohla být prosycena rozpouštědlem parafinu; odvodnění se provádí řadou alkoholů o stoupající koncentraci (viz. otázka č. 2)

3) Prosycování tkáně rozpouštědlem parafinu – jako rozpouštědla parafinu se používají:
a) látky s nižším bodem varu (benzen, xylen, toluen) – jsou to organická rozpouštědla, působí škodlivě na nervovou soustavu; odvodňování v těchto látkách provádíme ve třech lázních po 15 minutách (nemělo by probíhat déle než hodinu, protože potom tkáň tvrdne); protože jsou to látky s vysokým indexem lomu světla, dochází k projasnění tkáně, v místech kde ve tkáni zůstala voda, nedojde k projasnění, tato místa budou matná, u této tkáně musíme dokončit odvodnění v absolutním alkoholu
b) látky s vyšším bodem varu (metylbenzolát, metylsalycilát) – mají vysokou hustotu, proto do tkáně pronikají pomalu; odvodňování se provádí také ve třech lázních (1. 2 – 4 hod. , 2. 6 – 8 hod , 3. 8 – 12 hod.); po vložení tkáně do tohoto rozpouštědla, vzorek plave, po prosycení klesne na dno, protože je prosycen látkou s vyšší hustotou; tkáň po odvodnění projasní

4) Prosycení tkáně parafinem – aby se parafin dostal do tkáně, musí být v tekutém stavu, proto se prosycování provádí za tepla; bod tání parafinu je obvykle 50 – 60 °C (lepší je použít parafin s nižším bodem varu, aby se tkáň neporušila delším pobytem ve vysoké teplotě); tkáň se prosycuje ve třech lázních parafinu (parafin vytěsňuje rozpouštědlo a proniká do tkáně – lázeň parafinu se tak rozpouštědlem znečisťuje, proto se lázně musí vyměňovat); doba prosycování v jednotlivých lázních: 1. 6 hod, 2. 8 hod., 3. 12 hod.; tkáňové bločky přendaváme z jedné lázně do druhé nahřátou pinzetou, aby na ní netuhl parafin

5) Vlastní zalití do parafinu – přečištěný, tekutý parafin se nalije do zalévací komůrky; do ní vložíme tkáňový bloček prosycený parafinem, řeznou plochou na dno

6) Tmelení parafinových bločků – po ztuhnutí parafinu, se vyjme ze zalévací komůrky a nahřátým nožem se vykrojí tkáňový bloček (kolem tkáně se nechávají asi 0,5 cm okraje); tkáň se přitmelí na dřevěný špalíček, na který se dá nejprve tekutý parafin, přiloží se bloček a nahřátým nožem se objedou hrany bločku; bloček se označí

– Celoidin
Celoidin je tvrdé zalévací médium nerozpustné ve vodě.
– je to nitrát celulózy, suchý celoidin má vatovou strukturu – proceloidin, před použitím se musí rozpustit alkoholetherem na 10 % koncentraci
– proceloidin je výbušnina, nesmí se pracovat s otevřeným ohněm
POSTUP:
1) Fixace
– používá se jakákoliv fixační tekutina, kromě Buenovy tekutiny, protože kyselina pikrová v ní obsažená, brání pronikání celoidinu do tkáně

2) Odvodňování tkáňového bločku
– řadou alkoholů se stoupající koncentrací
70% – 2 hodiny
80% – 4-6 hodin
96% – 6 hodin
100% – 3x 2 hodiny

3) Prosycování rozpouštědlem celoidinu
– rozpouštědlem celoidinu je alkoholether (směs absolutního alkoholu a etheru v poměru 1 : 1)
– provádí se v dobře uzavřené nádobě, při pokojové teplotě 8 – 12 hodin

4) Prosycování tkáně celoidinem
– tkáň se prosycuje třemi koncentracemi celoidinu (2,5 % , 5 % a 10 %)
– provádí se v dobře uzavřené nádobce, aby neunikal ether, tím by se zvyšovala koncentrace a mohl by vzniknout až suchý celoidin
a) prosycování 2,5 % celoidinem – 24 hodin – 3 dny
b) prosycování 5 % celoidinem – 3 – 7 dní
c) prosycování 10 % celoidinem – 1 – 4 týdny

5) Vlastní zalití do celoidinu
– do skleněné nádobky s plochým dnem nalijeme 10 % celoidin
– celoidinu musí být dostatečné množství, protože při tuhnutí se jeho objem snižuje až o polovinu
– bloček zalitý do celoidinu přeneseme do nádobky – řeznou plochou na dno
– nejprve nádobku na několik hodin uzavřeme, aby mohli unikat bublinky
– poté ji mírně pootevřeme a necháme pomalu unikat ether, aby celoidin tuhl rovnoměrně
– zalévání se provádí v exsikátoru, kde je hygroskopická látka, aby se celoidin nemísil s vodou
– po ztuhnutí celoidinu se vykrojí celoidinový bloček, který se ukládá v 70 % alkoholu, aby nevysychal

6) Krájení
– krájí se na sáňkovém mikrotomu, šikmo nastaveným nožem
– při krájení se potírá v 70 % alkoholem, ve kterém se ukládají také řezy
Použití
– běžně se nepoužívá, protože doba zalévání je příliš dlouhá
– používá se pro zalévání tvrdých tkání (zub, kost, zvápenatělá chrupavka, šlacha), tyto tkáně by se špatně krájely v parafinu.