8. Průkaz nespecifické esterázy. Zpracování materiálu pro průkaz enzymů

8. Průkaz nespecifické esterázy.
Zpracování materiálu pro průkaz enzymů

Průkaz nespecifické esterázy
– provádí se azokopulační reakcí
PRINCIP: Působením enzymu se ze substrátu (sloučeniny naftolu) odštěpí naftol, který reaguje s diazoniovou solí (stabilizovaným diazotátem) vznikem barevné, ve vodě nerozpustné sraženiny – azobarviva. Výhodou této reakce je, že se naftoly v těle nevyskytují, proto je reakce specifická.

1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Inkubace při pokojové teplotě 10 – 20 minut; případně zvýšíme teplotu na 37°C Inkubační roztok: 0,2M fosfátový pufr pH 7,4 20ml alfa – nafthylacetát – substrát alfa do suché nádobky nejprve alfa – nafthylacetát, který rozpustíme v několika kapkách acetonu, potom pufr + diazovanou sůl (Fast Blue BB) alfa přefiltrovat
3) Oplach v dest. vodě, jádrová červeň 5 – 15 minut alfa dobarvení jader, oplach v dest. vodě
4) Montování do medií rozpustných ve vodě (např. glycerin)

VÝSLEDEK BARVENÍ
Černé azobarvivo v místě výskytu nespecifické esterázy
Jádra – červeně

VÝSKYT nespecifické esterázy – v cytoplazmě, v mitochondriích
Zpracování materiálu pro průkaz enzymů
Tkáň pro vyšetření enzymů má být zpracována co nejrychleji po odběru. Zpracovává se buď nefixovaná tkáň, protože se některé enzymy fixací inaktivují, nebo se zpracovává tkáň fixovaná.

– Zpracování nefixované tkáně
tkáň krájíme na zmrazovacím mikrotomu – kryostatu

– Zpracování fixované tkáně
k fixaci se používá vychlazený aceton nebo formol, fixujeme při 0 – 4 °C v ledničce; tkáň fixovanou acetonem zaléváme zkráceným způsobem do parafinu (prosycování tkáně rozpouštědlem parafinu i samotným parafinem zkracujeme na minimum); vychlazeným formolem (neutrálním formolem, Bakerovou tekutinou …) fixujeme v ledničce při 0 – 4 °C; tkáň fixovanou formolem krájíme na zmrazovacím mikrotomu nebo ji zkráceným způsobem zaléváme do parafinu; při odvodňování však nahrazujeme alkohol acetonem; doba fixace se pohybuje od 2 do 12 hodin

Při zpracování tkáně dochází vždy k částečnému poklesu enzymové aktivity