7. Barvení orceinem. Zpracování tvrdých tkání pro histologické vyšetření

7. Barvení orceinem.
Zpracování tvrdých tkání pro histologické vyšetření

Barvení orceinem
– barvící metoda na průkaz elastických vláken

1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Orcein – 30 – 60 minut při 38°C, oplach v dest. vodě
3) Diferenciace kyselým alkoholem, oplach v dest. vodě
4) Mayerův nebo Harrisův hematoxylin – 5-8 minut, oplach v pramenité vodě (-> modrání jader)
5) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování

VÝSLEDEK BARVENÍ
Elastická vlákna – sytě červenohnědě
Jádra – modře

Zpracování tvrdých tkání pro histologické vyšetření
Tvrdé tkáně, jako je zub, kost, zvápenatělá chrupavka, zvápenatělé vazivo, obsahují velké množství minerálních solí. Před zhotovením preparátu se musí tkáně těchto solí zbavit – demineralizace – dekalcifikace (odvápňování)

– Odvápňování
Spočívá v rozpuštění minerálních solí účinkem zředěných kyselin, které přemění nerozpustné soli. Tkáň musí být dobře fixována; po fixaci důkladně vyprána v alkoholu popř. ve vodě (podle druhu fixační tekutiny; odvápnění musí být rychlé; po skončení odvápňování musíme odstranit dekalcifikační tekutiny vypráním v roztoku nějaké soli – 5% kamenec draselný, 5ˇsíran sodný nebo lithný; odvápněnou tkáň nepřenášíme z dekalcifikační tekutiny do vody neboť by došlo ke zbobtnání vazivA. Doba odvápnění závisí na velikosti bločku a na druhu dekalcifikační tekutiny, správný stupeň odvápnění poznáme nejlépe naříznutím tkáně. Stupeň odvápnění lze určit i chemicky: k 5ml dekalcifikační tekutiny slité z odvápněné tkáně dáme 5ml hydroxidu amonného, 5 ml šťavelanu amonného, promícháme, necháme stát 15 – 30 sekund, roztok se mléčně kalí, tkáň není odvápněná. Odvápněnou tkáň můžeme krájet na zmrazovacím mikrotomu, nebo je zaléváme do celoidinu nebo celodalu, lze zalít i do parafínu, ale obtížně se krájí.

– Dekalcifikační tekutiny
– 5% kyselina dusičná – potom tkáň vypíráme 24hodin v 5% síranu sodném nebo litném a pak 24hodin v tekoucí vodě
– 5% kyselina trichloroctová – potom pereme v 96%, 90% alkoholu
– kyselina mravenčí, odvápnění šetrné, zůstává barvitelnost tkání
– EDTA (kyselina etylendiaminotetraoctová)