3. Barvením zeleným trichromem. Zalévání do želatiny, princip a použití

3. Barvením zeleným trichromem.
Zalévání do želatiny, princip a použití

Barvení zeleným trichromem
– přehledná barvící metoda, slouží k odlišení kolagenního vaziva
1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv – oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu světlá zeleň – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování

VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – zeleně
Svalstvo – červeně

Zalévání do želatiny, princip a použití
– želatina je měkké zalévací médium rozpustné ve vodě
– používá se pro zalévání řídkých tkání, které chceme zpevnit, nebo pokud tkáň chceme uchovat delší dobu
– želatina vytěsní z tkáně vodu, která je mezi buňkami
– prosycení tkáňového bločku vypraného ve vodě postupně v koncentrátu želatiny při 37°C, pak se bloček schladí, želatina ztuhne a bloček se stvrdí ve formolu, krájí se na zmrazovacím mikrotomu

POSTUP:
1) tkáňové bločky fixujeme formolem, vypereme v tekoucí vodě – 24 hodin
2) prosycování 10% roztokem želatiny při teplotě 37°C – 2 – 4 hodiny
3) prosycování 20% roztokem želatiny při 37°C – 4 – 6 hodin
4) zalití bločku do 20% roztoku želatiny do kovové nebo papírové krabičky
5) želatinu necháme ztuhnout
6) tvrzení želatinových bločků ve 20% formolu – 24 hodin
7) praní želatinových bločků ve vodě a krájení na zmrazovacím mikrotomu

Příprava roztoku želatiny
Roztok 10% – 20% želatiny se připraví rozpuštěním odváženého množství želatiny; želatinu necháme 15 minut zbobtnat a pak rozpustíme ve vodní lázni nebo termostatu za účelem konzervace přidáme krystalek thymolu.