4. Barvení modrým trichromem. Zalévání do celoidinu, postup a použití

Barvením modrým trichromem
– přehledná barvící metoda, slouží k odlišení kolagenního vaziva

1) Deparafinace (X1, X2, A1, A2) – 5 minut, oplach ve vodě – 5 minut
2) Weigertův železitý hematoxylin (A = 1% hematoxylin v 96% alkoholu, B = dest. voda, chlorid železitý, HCl -> A+B=1:1) 3 – 10 minut, oplach vodou, po obarvení není nutné diferencovat, pouze pokud došlo k přebarvení tkáně, k diferencování používáme kyselý alkohol, pokud diferencujeme důkladně propíráme ve vodě
3) Roztok červeně (směs červených barviv – oranž G, kyselý fuchsin) – 1-3 minuty, oplach v dest. vodě
4) Moření 1% kyselinou fosfomolibdenovou (moření podporuje barvitelnost kolagenních vláken) – 3 – 5 minut
5) Bez oplachu anilinová modř – 5 minut, oplach v dest. vodě
6) Diferencování v 1% kyselině octové
7) Odvodnění (A1, A2, KX); projasnění (X1, X2); montování

VÝSLEDEK BARVENÍ
Jádra – modře až hnědočerně
Kolagenní vazivo – modře
Svalstvo – červeně

Zalévání do celoidinu, postup a použití
Celoidin je tvrdé zalévací médium nerozpustné ve vodě.
– je to nitrát celulózy, suchý celoidin má vatovou strukturu – proceloidin, před použitím se musí rozpustit alkoholetherem na 10 % koncentraci
– proceloidin je výbušnina, nesmí se pracovat s otevřeným ohněm

POSTUP:
1) Fixace
– používá se jakákoliv fixační tekutina, kromě Buenovy tekutiny, protože kyselina pikrová v ní obsažená, brání pronikání celoidinu do tkáně

2) Odvodňování tkáňového bločku
– řadou alkoholů se stoupající koncentrací
70% – 2 hodiny
80% – 4-6 hodin
96% – 6 hodin
100% – 3x 2 hodiny

3) Prosycování rozpouštědlem celoidinu
– rozpouštědlem celoidinu je alkoholether ( směs absolutního alkoholu a etheru v poměru 1 : 1 )
– provádí se v dobře uzavřené nádobě, při pokojové teplotě 8 – 12 hodin

4) Prosycování tkáně celoidinem
– tkáň se prosycuje třemi koncentracemi celoidinu ( 2,5 % , 5 % a 10 % )
– provádí se v dobře uzavřené nádobce, aby neunikal ether, tím by se zvyšovala koncentrace a mohl by vzniknout až suchý celoidin
a) prosycování 2,5 % celoidinem – 24 hodin – 3 dny
b) prosycování 5 % celoidinem – 3 – 7 dní
c) prosycování 10 % celoidinem – 1 – 4 týdny

5) Vlastní zalití do celoidinu
– do skleněné nádobky s plochým dnem nalijeme 10 % celoidin
– celoidinu musí být dostatečné množství protože při tuhnutí se jeho objem snižuje až o polovinu
– bloček zalitý do celoidinu přeneseme do nádobky – řeznou plochou na dno
– nejprve nádobku na několik hodin uzavřeme, aby mohli unikat bublinky
– poté ji mírně pootevřeme a necháme pomalu unikat ether, aby celoidin tuhl rovnoměrně
– zalévání se provádí v exsikátoru, kde je hygroskopická látka, aby se celoidin nemísil s vodou
– po ztuhnutí celoidinu se vykrojí celoidinový bloček, který se ukládá v 70 % alkoholu, aby nevysychal

6) Krájení
– krájí se na sáňkovém mikrotomu, šikmo nastaveným nožem
– při krájení se potírá v 70 % alkoholem, ve kterém se ukládají také řezy
Použití
– běžně se nepoužívá, protože doba zalévání je příliš dlouhá
– používá se pro zalévání tvrdých tkání (zub, kost, zvápenatělá chrupavka, šlacha), tyto tkáně by se špatně krájely v parafinu.